顯微鏡之介紹
  

         光學顯微鏡是為了使肉眼看不清楚的標本影像,人們設想經過一種裝置,使肉眼能夠觀察到該標本組織形態和其間的結構。這種設想的裝置就被後人創造問世了。當前廣泛應用在各種微小物體的觀察、測定、分析、分類、鑑定等。在波長範圍上也不限於可見光波段(4000~7000 A.GIF (903 bytes))而且(>2000 A.GIF (903 bytes))到紅外(1~2u)以及用眼睛觀察、顯微、攝影和一般輻射檢測器放大。

         顯微鏡的分類是根據照明方法,有透射型與反射(落射)型二種。透射型顯微鏡是應用透射照明通過透明物體的打光方法。反射型顯微鏡是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。另一種分類方法,係根據觀察方法的差異,分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相位差顯微鏡、偏光顯微鏡、干涉相位差顯微鏡、螢光顯微鏡等。每種顯微鏡一般又各有透射型和反射型二種。在這些顯微鏡中,特別是明視野顯微鏡是構成所有顯微鏡中組成最基本的基礎。通過這種顯微鏡觀察的物體,穿過透過(吸收)率、反射率,因場所不同而各不相同,這種物體被稱為隨照明光強度(振幅)變化振幅物體,無色透明物體只有在照明相位改變時,才能被肉眼觀察到,由於明視野顯微鏡不能改變相位,所以對透明不染色標本不能被觀察到。

倍率、數值孔徑與視場數

        
顯微鏡的綜合倍率是物鏡倍率G1與目鏡倍率G2的乘積,G=G1×G2。G1是1~100倍,G2是5~20的範圍。

         數值孔徑(Numerical Aperture)N.A.是決定物鏡的分辨率、焦深、圖像亮度的基本數據,如圖所示,當物鏡焦點對好後,物鏡前透鏡最邊緣處的傾斜光線與顯微鏡光軸所交角成α,此即該物鏡的半孔徑角設標本數據空間的折射率為n,則N.A.=n×sinα。     

L01.GIF (16453 bytes)

        
n通常在空氣中為1,在物鏡與標本間浸入水、甘油、油脂時,該標本折射率,即隨浸液不同而異。這種物鏡稱為浸液系物鏡;如是空氣時,稱為乾燥系物鏡。圖1左半部分表示浸液系,右半部分表示乾燥系的情況。

         在顯微鏡上,限制視野的裝置是視野光圈。以物鏡側觀看這種視野光圈時的直徑以mm單位表示的值稱為視野數。實際視野=視野。

實際視野=視野數/物鏡倍率

         例如,視野數為20,則10×物鏡就觀看2mm視野範圍。應用聚光鏡時,根據可變的視野光圈,再決定選用聚光鏡的N.A.值,其值是取決於可變聚光鏡孔徑光圈來確定。

暗視野顯微鏡

L02.GIF (27206 bytes)

        暗視野顯微鏡由於不將透明光射入直接觀察系統,無物體時,視野暗黑,不可能觀察到任何物體,當有物體時,以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野觀察物體,照明光大部分被折回,由於物體(標本)所在的位置結構,厚度不同,光的散射性,折光等都有很大的變化。


相位差顯微鏡

相位差顯微鏡的結構:
        相位差顯微鏡,是應用相位差法的顯微鏡。因此,比通常的顯微鏡要增加下列附件:
(1) 裝有相位板(相位環形板)的物鏡,相位差物鏡。
(2) 附有相位環(環形縫板)的聚光鏡,相位差聚光鏡。
(3) 單色濾光鏡-(綠)。

各種元件的性能說明如下:
(1) 相位板使直接光的相位移動 90°,並且吸收減弱光的強度,在物鏡後焦平面的適當位置裝置相位板,相位板必須確保亮度,為使衍射光的影響少一些,相位板做成環形狀。相位板,相位膜及吸收膜加工成圖5形狀。

(2) 相位環(環狀光圈)是根據每種物鏡的倍率,而有大小不同,可用轉盤器更換。

 

(3) 單色濾光鏡係用中心波長546nm(毫微米)的綠色濾光鏡。通常是用單色濾光鏡入觀察。相位板用特定的波長,移動90°看直接光的相位。當需要特定波長時,必須選擇適當的濾光鏡,濾光鏡插入後對比度就提高。此外,相位環形縫的中心,必須調整到正確方位後方能操作,對中望遠鏡就是起這個作用部件。

L03.GIF (43453 bytes)

使用時的注意事項
使用時,最重要的注意事項為下列三點:
(1)執行正確的操作方法。
(2)根據標本的要求,選擇合適的相位差物鏡。
(3)用其他觀察方法作比較,對標本作出正確的判斷。
  1.正確操作的最重要事項必須正確地調整好相位環的中心。若用圖6中的幾種形狀的容器,是不能正確地調到中心位置的。因而作為相位差觀察用是不合適的。

L04.GIF (35190 bytes)

    
對相位差像的判斷和明視野象的判斷是不相同的。要注意相差法所持有的特點和不足點,相位差物鏡的選擇方法同上。要與其他的觀察法作比較,以及正確地製作標本的方法,這些都是使用時必要的綜合注意事項。


螢光顯微鏡

         在螢光顯微鏡上,必須在標本的照明光中,選擇出特定波長的激發光,以產生螢光,然後必須在激發光和螢光混合的光線中,單把螢光分離出來以供觀察。因此,在選擇特定波長中,濾光鏡系統,成為極其重要的角色。

螢光顯微鏡原理:
(A) 光源:光源幅射出各種波長的光(以紫外至紅外)。
(B) 激勵濾光源:透過能使標本產生螢光的特定波長的光,同時阻擋對激發螢光無用的光。
(C) 螢光標本:一般用螢光色素染色。
(D) 阻擋濾光鏡:阻擋掉沒有被標本吸收的激發光有選擇地透射螢光,在螢光中也有部分波長被選擇透過。

L05.GIF (40144 bytes)